Stopped-Flow
Спектроскопия
в остановленном потоке (stopped-flow) является техникой, используемой
для изучения механизмов быстрых реакций в растворах во временном
масштабе от 1 мс до 100 с. Общая схема предполагает быстрое смешивание
двух реагентов и "остановку" в кювете. Кювету с образцом облучают
монохроматическим светом (обычно), и в ходе реакции регистрируют
изменяющийся сигнал, обычно флуоресценцию или абсорбцию на определенной
длине волны, как функцию от времени. Анализ полученных кинетических
данных используют для определения коэффициентов, порядка реакции,
механизма реакции, а также выявления короткоживущих интермедиатов и др.
Серия экспериментов в остановленном потоке дает возможность показать
эффект воздействия таких параметров, как температура, рН и концентрация
реагентов на кинетику реакции.
Типичные области исследований включают изучение механизмов реакции,
процессов связывания лекарственных препаратов, определение структуры
белковых молекул. Более подробно:
• Белок-белковые взаимодействия
• Связывание лигандов
• Перенос электронов
• FRET (Fluorescence resonance energy transfer)
• Фолдинг белков
• Ферментативные реакции
• Химические реакции
• Координационные реакции
По оценкам большинство университетов в Великобритании и США имеют по
крайней мере один спектрометр остановленного потоака, а некоторые даже
два и более.
1. Принцип метода остановленного потока (Stopped-Flow)
Приведенная ниже схема типичное устройство блока остановленного
потока. Останавливающий механизм в данном примере представлен шприцом с
задним упором. Реагенты подаются из двух управляемых шприцов (С и F).
Поршневой привод толкает пистоны шприцов, и таким образом реагенты
продвигаются через трубки к смесителю, а затем в измерительную кювету.
Этот процесс выдавливает отработанное содержимое из кюветы в
останавливающий шприц (stop-syringe). Поток наполняет этот шприц, пока
пистон не упрется в триггерный переключатель; это действие одновременно
останавливает поток и запускает регистрацию сигнала. От начала реакции
только что смешанных реагентов в измерительной кювете до этого момента
проходит примерно 1 миллисекунда. Точное время (так называемое,
мертвое время) зависит от устройства прибора и кюветы.
Рисунок 1. Схематическое
изображение одномодульной смешивающей системы, используемой в
спектрометре остановленного потока SX20 производства.
Некоторые устройства остановленного потока не используют
останавливающий шприц; вместо этого поток останавливается, когда
останавливается привод; это действие обычно координируется с закрытием
клапана в проточной трубке на выходе из кюветы для уверенности в том,
что поток остановлен вместе с остановкой привода.
На рисунке 2 более подробно показан вид кюветы. При данном дизайне
смеситель интегрирован в кювету. Доступны две длины оптического пути
для детекции поглощения (2 мм и 10мм, или 1 мм и 5 мм – в зависимости
от типа кюветы). Кювета имеет фиксированное окно для регистрации
флуоресценции – это является особенностью устройства кюветы в SX20.
Рисунок 2. Изображение оптической кюветы Applied Photophysics SX20 stopped-flow.
2. Одноактное и последовательное смешивание
Модуль последовательного смешивания, также называемый модулем
двойного смешивания, является часто требуемой вариацией технологии
остановленного потока (доступен в качестве приставки к SX20). Эту
установку обычно используют для изучения взаимодействий между
короткоживущими интермедиатами и третим реагентом.
Приведенная ниже схема показывает типичное устройство для
последовательного смешивания. В эксперименте с последовательным
смешиванием два реагента (А и В) быстро смешиваются и подаются в
петлю для выдерживания. После предварительной инкубации (от
миллисекунды до 10 секунд) содержание петли быстро смешивается с
третьим реагентом (С) в кювете и реакция (между короткоживущим
интермедиатом и С) проходит так же, как при однофазном смешивании.
Рисунок 3. Схема
модуля последовательного смешения спектрометра остановленного потока
Applied Photophysics SX20 stopped-flow с опцией SX/SQ.
3. Ключевые элементы спектрометра остановленного потока
Источник света
Обычно источником света является ксеноновая дуговая лампа, так как она
интенсивно излучает на широком диапазоне длин волн (от дальнего
УФ до ближнего ИК) и значительную интенсивность, достаточную для
флуоресцентных измерений. Для специфических исследований иногда
применяют альтернативные источники света; например, ксенон-ртутная
лампа может быть предпочтительной для флуоресцентных измерений, в
которых интенсивное излучение ртути возбуждает интересующие флуорофоры.
Монохроматор
Для выбора длины волны возбуждающего света для флуоресцентных измерений или нужной длины волны для измерения поглощения.
Модуль подачи образца
Для быстрого смешивания реагентов в измерительной кювете и координирования остановки потока со стартом детекции сигнала.
Система детекции
Обычно один детектор на основе фотоумножителя (или больше), способный
регистрировать изменения в поглощении, флуоресценции и светорассеянии.
Детекторы на основе фотодиодной матрицы также используются для
регистрации время-разрешенных спектров (многоволновые кинетические
данные).
Компьютер и программное обеспечение для управления
Большая часть процессов находится под управлением программного обеспечения.
Аналитическое программное обеспечение
Фиттинг кривых и, иногда, глобальное аналитическое ПО для фитинга многоволновых кинетических данных.
Водный рециркулятор с водным контролем
Для регуляции температуры реагентов и кюветы.
Это основные элементы любого спектрометра остановленного потока.
Желательные характеристики, с высокой вероятностью, включают в себя:
высокий уровень автоматизации, хорошие технические характеристики;
высокую чувствительность , малое мертвое время и низкий объем расхода
реагентов, а также большой набор дополнительных модулей и
альтернативных опций детекции.
SX20 Stopped-Flow Spectrometer
SX20 является золотым стандартом в области изучения кинетики химических реакций в остановленном потоке.
Наиболее совершенный и удобный в эксплуатации спектрометр остановленного потока, доступный сегодня, обладающий непревзойдённой чувствительностью и скоростью работы.
Уникальная точность при работе с микрообъемами; непревзойденная чувствительность;
Частота импульсов превышает 3000 с-1 с мертвым временем менее 500 мкс;
Оптимизирован для работы в режимах поглощения и флуоресценции;
Мощное, простое в использовании программное обеспечение для регистрации, вывода и анализа данных;
Поддержка и обучение пользователей в соответствии с международными стандартами для достижения лучших результатов.
RX2000 Rapid Mixing Stopped-Flow Unit
Advanced kinetics capabilities for your Uv-Vis/Flu spectrometer
The RX2000 is a high performance, versatile stopped-flow accessory that enables your existing UV-Vis spectrometer, fluorimeter or CD spectrometer to be used to follow reactions that are at least a thousand fold faster than those run by manual methods.